Subzelluläre Kartierung von Umbauprozessen des Zytoskeletts
Moch, M., Herberich, G., Aach, T., Leube, R. E., Windoffer, R.
Proc Natl Acad Sci U S A. 110:10664 – 10669
http://www.pnas.org/content/110/26/10664.abstract
Measuring the regulation of keratin filament network dynamics.
Zusammenfassung
Das Zytoskelett einer Zelle besteht aus einem dreidimensionalen Gerüst, das nicht nur die mechanischen Eigenschaften einer Zelle verantwortlich ist, sondern auch an nahezu allen Zellprozessen beteiligt ist. Die Bewältigung der vielfältigen Aufgaben beruht auf einer zeitlich und räumlich äußerst präzise gesteuerten Plastizität des Zytoskeletts und seiner molekularen Bestandteile. Um diese Eigenschaften zu analysieren, ist die hochaufgelöste quantitative Messung der Zytoskelett-Dynamik unter verschiedenen experimentellen Bedingungen notwendig.
In einer engen Zusammenarbeit des Instituts für Molekulare und Zelluläre Anatomie (MOCA) und des Lehrstuhls für Bildverarbeitung (LfB) wurde die Plastizität des epithelialen Zytoskeletts untersucht, das durch Keratin-Intermediärfilamente gekennzeichnet ist. Diese haben als Differenzierungsmarker in der Tumordiagnostik einen zentralen Stellenwert, und Veränderungen der Keratinfilamente führen zu blasenbildenden Hauterkrankungen. Von lebenden Epithelzellen, deren Keratin-Zytoskelette fluoreszenzmarkiert waren, wurden hochauflösende fluoreszenzmikroskopische Zeitrafferaufnahmen hergestellt. Die daraus abgeleiteten Filmsequenzen zeigten, dass die Zytoskelettnetzwerke kontinuierlich umgebaut werden. Die rein visuelle Inspektion reichte jedoch nicht aus, die unterschiedliche Ausprägung der Bewegungsmuster und lokal gesteuerten Umbauprozesse präzise zu erfassen. Es wurden daher Bildverarbeitungsverfahren entwickelt, mit denen Transportvorgänge sowie Aufbau und Abbau des Keratinzytoskeletts quantitativ bestimmt werden konnten. So gelang der objektivierbare Nachweis, dass Keratinfilamente in definierten Zellregionen entstehen bzw. verschwinden und dass sie gerichtet transportiert werden. Zudem konnten wir zeigen, dass diese zyklisch stattfindenden Prozesse in mobilen Zellen schneller ablaufen als in sessilen Zellen und dass sie durch Wachstumsfaktoren beschleunigt werden. Damit stehen nun Werkzeuge zur Verfügung, mit denen die Eigenschaften und Steuerungsprinzipien des normalen und krankheitsbedingt veränderten Intermediärfilament-Zytoskeletts in spezifischen Zellkompartimenten auf molekularer Ebene untersucht werden können.
Subcellular mapping of cytoskeletal dynamics - Abstract
The cytoskeleton provides a 3-dimensional scaffold, which not only defines the mechanical properties of a cell but is also involved in nearly all cellular processes. These diverse tasks rely on a precise spatio-temporal regulation of the cytoskeleton and its molecular components. The quantification of these dynamics under different experimental conditions is quite challenging and essential to characterize the contribution of various factors to the regulation of cytoskeletal dynamics.
In a tight collaboration of the Institute of Molecular and Cellular Anatomy (MOCA) and the Institute of Imaging and Computer Vision (LfB) the plasticity of the epithelial cytoskeleton was examined. It is characterized by keratin intermediate filaments. The detection of keratin polypeptides is commonly used in tumor diagnosis and mutated keratin filaments have been shown to cause a variety of skin blistering diseases. Using confocal microscopy high resolution time lapse movies of living cells with fluorescently tagged keratins were recorded. Visual inspection revealed a continuous remodeling of the network. This method, however, was not suitable for comparative quantification and was insufficient to detect minor differences. Image analysis tools were therefore developed that allowed to quantify the transport, assembly and disassembly of keratin filaments. Using these tools we were able to localize keratin filament assembly and disassembly to specific cell regions and to determine inward-directed transport of keratin filaments. Furthermore, we could demonstrate that the rates of these processes are higher in mobile cells and that they can be accelerated by growth factors. These results exemplify that the newly developed tools can be used to investigate the properties and regulation of normal and pathologically altered intermediate filaments in specific subcellular compartments at the molecular level.